Quando falta sangue no tubo de EDTA: como o excesso relativo de anticoagulante pode alterar o hemograma

“Mas a máquina conseguiu fazer o exame.”

Essa é uma frase que aparece com frequência quando discutimos amostras com volume abaixo do recomendado.

E, de fato, um analisador hematológico pode conseguir aspirar e processar uma amostra mesmo quando o tubo está parcialmente preenchido.

Mas existe uma diferença fundamental entre conseguir analisar uma amostra e ter uma amostra adequada para produzir um resultado confiável.

Na hematologia, a fase pré-analítica começa muito antes de o sangue chegar ao equipamento. O tipo de tubo, o anticoagulante, a quantidade de sangue coletada, a homogeneização, o tempo até a análise e as condições de armazenamento podem interferir na qualidade da amostra e, consequentemente, na interpretação do hemograma.

A própria American Society for Veterinary Clinical Pathology (ASVCP) considera o preenchimento e a homogeneização adequados dos tubos parte das boas práticas para hematologia veterinária.

O EDTA não está no tubo por acaso

Para a realização do hemograma, o sangue de mamíferos é habitualmente coletado em tubos contendo EDTA, geralmente nas formas de sais de dipotássio (K₂-EDTA) ou tripotássio (K₃-EDTA).

EDTA significa ácido etilenodiaminotetracético.

Sua principal função como anticoagulante é quelar o cálcio (Ca²⁺). O cálcio é essencial para diversas etapas da cascata de coagulação e, ao ser sequestrado pelo EDTA, a coagulação é impedida.

Essa propriedade faz do EDTA um excelente anticoagulante para hematologia porque, em concentrações adequadas, permite preservar relativamente bem as células para contagem e avaliação morfológica.

Mas existe uma condição fundamental:

A concentração de EDTA precisa estar adequada ao volume de sangue.

O tubo é fabricado contendo uma quantidade de anticoagulante planejada para um determinado volume de sangue.

Por isso, o objetivo não é simplesmente colocar sangue em um tubo que contenha EDTA.

É manter uma relação adequada entre sangue e anticoagulante.

O que acontece quando o tubo é subpreenchido?

Imagine um tubo destinado a receber 4 mL de sangue.

Se conseguimos coletar apenas 1 mL, aquele 1 mL de sangue estará em contato com uma quantidade de EDTA que foi dimensionada para um volume muito maior.

Portanto, temos:

menos sangue + a mesma quantidade de anticoagulante = maior concentração relativa de EDTA

Esse é o ponto central.

Não estamos simplesmente diante de “pouco sangue”.

Estamos diante de uma alteração da relação sangue:anticoagulante.

E isso pode modificar as condições físico-químicas às quais as células estão expostas.

Por que o EDTA pode fazer a hemácia encolher?

Aqui existe uma explicação importante, e que muitas vezes é simplificada demais.

Não é correto pensar simplesmente que “o potássio do EDTA encolhe a hemácia”.

O fenômeno está relacionado principalmente à concentração/osmolalidade do meio.

Quando existe EDTA em concentração excessivamente alta em relação ao volume de sangue, o meio pode se tornar hipertônico para as células. Como consequência, água pode sair das hemácias, levando à retração ou encolhimento eritrocitário.

A literatura descreve esse fenômeno há décadas, sendo particularmente evidente com concentrações elevadas de K₃-EDTA. Estudos experimentais relacionaram o aumento da concentração de anticoagulante à redução do volume eritrocitário, atribuída ao encolhimento das hemácias em um meio hipertônico.

A ASVCP também descreve que o subpreenchimento de tubos contendo K₃-EDTA pode produzir resultados errôneos pela exposição das células ao elevado conteúdo de sais, causando retração eritrocitária.

E o que acontece com o resultado do hemograma quando a hemácia encolhe?

Aqui está uma das partes mais importantes para quem interpreta exames.

Se a hemácia perde água e diminui de tamanho, o volume corpuscular médio (VCM) pode ser afetado.

Isso significa que uma amostra inadequada pode produzir um resultado que se parece com uma alteração eritrocitária verdadeira.

Por exemplo:

VCM ↓

pode levar o clínico a pensar em microcitose.

Mas antes de interpretar essa alteração como uma característica do paciente, é importante perguntar:

Como essa amostra foi coletada?

A ASVCP destaca que o encolhimento celular decorrente do subpreenchimento afeta especialmente o PCV manual, enquanto o comportamento do HCT obtido por analisadores automatizados pode ser diferente, justamente porque as metodologias utilizadas não são equivalentes.

Esse é um excelente exemplo de por que não devemos transformar uma interferência pré-analítica em uma regra simples do tipo: “Pouco sangue sempre causa X.”

A resposta depende de qual tubo foi utilizado, qual EDTA está presente, quanto o tubo foi subpreenchido, qual parâmetro está sendo avaliado e qual metodologia o laboratório utiliza.

Mas como o equipamento “vê” essa hemácia?

Essa é uma distinção muito importante.

O equipamento não necessariamente está “errando”.

Ele está analisando a célula que está presente naquela amostra.

Se uma hemácia sofreu alteração de volume antes de chegar ao analisador, o equipamento pode medir corretamente aquela hemácia alterada.

Por isso, podemos ter uma situação em que: a análise instrumental está funcionando corretamente mas a amostra não representa perfeitamente o estado original do paciente.

Essa diferença entre erro analítico e alteração pré-analítica é fundamental.

O equipamento não sabe que aquela hemácia encolheu porque o tubo estava subpreenchido.

Ele simplesmente recebe uma população de hemácias com determinadas características e realiza a mensuração de acordo com sua metodologia.

E a CHCM?

Como o VCM pode ser alterado pelo encolhimento eritrocitário, outros índices hematimétricos podem sofrer repercussões.

A CHCM (concentração de hemoglobina corpuscular média) pode apresentar alterações, dependendo da metodologia e da condição da amostra.

Por isso, uma combinação como: VCM reduzido + CHCM aumentada

precisa ser interpretada com cuidado quando existe suspeita de alteração pré-analítica.

Não significa automaticamente que o paciente apresenta uma alteração eritrocitária verdadeira.

Da mesma forma, não significa que a alteração seja necessariamente causada pelo EDTA.

O contexto da amostra ajuda a determinar quanto aquele resultado pode ser confiável.

O efeito não é necessariamente igual para todos os analisadores

Esse é um ponto que merece bastante atenção.

Diferentes equipamentos utilizam diferentes metodologias para determinar parâmetros hematológicos.

Por isso, uma mesma condição pré-analítica pode produzir efeitos diferentes dependendo do sistema analítico.

Um estudo experimental de Lippi e colaboradores avaliou tubos de K₂-EDTA seco preenchidos com diferentes volumes e analisados em um Sysmex XN-10. Nesse estudo, não foram observadas variações clinicamente significativas até 67% do volume nominal. Em volumes menores, porém, surgiram vieses clinicamente relevantes em diferentes parâmetros, incluindo hematócrito, VCM, CHCM e, nos volumes mais baixos, RBC, hemoglobina e MPV.

Esse estudo é particularmente interessante porque demonstra experimentalmente uma coisa importante: o grau de preenchimento importa.

Mas ele também precisa ser interpretado dentro de suas condições experimentais: sangue humano, K₂-EDTA seco e um determinado analisador.

Não podemos transformar esses resultados em uma regra universal para todos os tubos, espécies e equipamentos veterinários.

E não são apenas as hemácias

Quando pensamos em excesso relativo de EDTA, a primeira alteração que normalmente vem à cabeça é o encolhimento eritrocitário.

Mas as condições inadequadas de anticoagulante também podem afetar a avaliação de outras células.

Há relatos de alterações morfológicas envolvendo plaquetas e leucócitos em condições inadequadas de concentração e tempo de exposição ao EDTA. O efeito, entretanto, varia conforme o sistema, concentração do anticoagulante, tempo e metodologia. Estudos comparando K₂ e K₃-EDTA também demonstram que concentrações elevadas podem afetar diferentes parâmetros hematológicos.

Por isso, não devemos pensar no tubo apenas como um recipiente para “impedir que o sangue coagule”.

O anticoagulante precisa manter as células em condições suficientemente adequadas para aquilo que pretendemos medir.

E existe outro problema: a homogeneização

Agora chegamos a uma segunda questão que pode ser esquecida quando discutimos tubos subpreenchidos.

Não é apenas a quantidade de EDTA que importa.

A amostra também precisa ser adequadamente homogeneizada.

Assim que o sangue entra no tubo, ele deve ser gentilmente misturado ao anticoagulante. A ASVCP recomenda inversões suaves imediatamente após o preenchimento para evitar a formação de coágulos.

Isso é particularmente importante porque sangue não é uma suspensão perfeitamente homogênea.

As hemácias possuem densidade maior e tendem a sedimentar.

Enquanto isso, leucócitos e plaquetas ficam relativamente mais concentrados na porção superior.

Se a amostra permanece em repouso e não é adequadamente homogeneizada antes da análise, a região da qual o equipamento aspira a amostra pode influenciar a contagem obtida. A própria ASVCP alerta que o efeito da sedimentação depende do local em que a agulha do instrumento aspira a alíquota.

E quando a quantidade de sangue é muito pequena?

Aqui precisamos ter cuidado para não criar uma regra simplista de que “pouco sangue não homogeneiza”.

O problema é que, em uma coleta muito pequena e difícil, a margem para uma mistura inadequada pode aumentar, especialmente se o tubo não for manipulado imediatamente e de maneira apropriada.

Além disso, quando existe coagulação parcial ou microcoágulos, algumas células podem ficar presas nesse material.

Isso é especialmente importante para as plaquetas.

Uma amostra pode não apresentar necessariamente um grande coágulo visível a olho nu e, ainda assim, apresentar alterações suficientes para interferir na contagem celular.

A ASVCP recomenda rejeitar amostras com coágulos e destaca que pequenos coágulos podem não ser facilmente identificados por inspeção visual, além de poderem aprisionar células e alterar as contagens.

E aqui entramos diretamente na interpretação clínica

Imagine que você recebe o seguinte resultado:

Plaquetas: 80.000/µL

O paciente está trombocitopênico?

Talvez.

Mas agora você descobre que a coleta foi muito difícil, o animal permitiu apenas um pequeno volume de sangue e o tubo não foi adequadamente preenchido.

Essa informação não significa:

“A trombocitopenia é falsa.”

Mas significa:

“A condição dessa amostra precisa ser considerada antes de eu interpretar essa trombocitopenia como uma característica do paciente.”

Nesse contexto, a avaliação do esfregaço sanguíneo torna-se extremamente importante.

Agregados plaquetários, por exemplo, podem causar contagens automatizadas falsamente reduzidas.

Portanto, diante de uma trombocitopenia inesperada, é fundamental perguntar:

Há agregados?A amostra está íntegra?Há microcoágulos?Como foi realizada a coleta?O resultado é coerente com resultados anteriores?O paciente apresenta sinais clínicos compatíveis?

O número isolado não conta toda a história.

“Mas na veterinária nem sempre conseguimos coletar o volume ideal.”

E essa é uma realidade que precisa ser reconhecida.

Na medicina veterinária, trabalhamos frequentemente com situações muito diferentes daquelas encontradas na medicina humana:

• cães e gatos muito pequenos;

• gatos extremamente reativos;

• pacientes agressivos;

• pacientes debilitados;

• animais com acesso vascular difícil;

• pacientes pediátricos;

• situações em que o volume sanguíneo disponível é limitado.

Nem toda coleta será perfeita.

E reconhecer isso não significa abandonar os princípios de qualidade laboratorial.

Significa entender o que a condição daquela coleta pode provocar no resultado.

Uma amostra fora do padrão não deve ser automaticamente tratada como se fosse uma amostra ideal.

Da mesma forma, não deve ser automaticamente descartada sem considerar o contexto, o exame solicitado, o grau da alteração e a possibilidade de obter uma nova amostra.

O importante é conhecer a limitação.

Por isso, o tubo deveria ser escolhido antes da coleta

Essa é uma medida simples que pode evitar muitos problemas.

Se você sabe que está diante de um animal de pequeno porte ou de uma situação em que provavelmente conseguirá apenas um pequeno volume de sangue, pense no tubo antes de realizar a coleta.

Existem tubos destinados a menores volumes, e a ASVCP recomenda o uso de tubos de pequeno volume para animais pequenos.

O objetivo é manter uma relação adequada entre a quantidade de sangue e o anticoagulante.

Ou seja:

Não escolha o tubo apenas pelo exame.

Escolha também considerando o volume de sangue que você provavelmente conseguirá obter.

O resultado começa antes do equipamento

É tentador pensar no laboratório como uma sequência:

coleta → máquina → resultado.

Mas, na realidade, existe uma cadeia muito maior:

paciente → coleta → tubo → anticoagulante → volume → homogeneização → transporte → preparação → análise → resultado → interpretação.

Qualquer alteração relevante ao longo desse processo pode interferir naquilo que finalmente chega ao laudo.

É por isso que a fase pré-analítica é tão importante na qualidade laboratorial. As diretrizes da ASVCP destacam que a otimização dessa etapa é essencial para obter amostras de qualidade e reduzir a variabilidade decorrente da falta de padronização.